Ma bardzo długą historię stosowania w ziołolecznictwie. Jest zalecana na padaczkę, astmy, choroby skóry i wysypki. W medycynie ludowej używana na problemy oddechowe, takie jak astma, zapalenie oskrzeli, przeziębienia, ma właściwości wykrztuśne (rozrzedza flegmę), wykorzystywana w leczeniu dolegliwości, takich jak koklusz, ostre zapalenie oskrzeli, zapalenie tchawicy, kaszel, astma. Ma również działanie moczopędne, przydatne w leczeniu reumatyzmu i zapalenia pęcherza. W medycynie ludowej czasami stosowana w przypadkach koszmarów, bezsenności lub snu z częstymi przebudzeniami. Wyciągiem z fiołka trójbarwnego płukano jamę ustną oraz gardło. Podawana w postaci herbatki, uspokaja nerwy, obniża gorączkę, ułatwia wydalanie toksyn. Maść natomiast, zwalcza wiele chorób skóry, takich jak trądzik, egzema i suchość skóry. Ze względu na obecność salicylanów i rutyny ma uznane właściwości przeciwzapalne. Wyciągi z rośliny są antybakteryjne.